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Bioss流式讲堂|多色搭配大师懂这些就够了
发表者:北京亚美游生物      发表时间:2018-10-30

知识要点:荧光标记的流式抗体种类繁多,荧光素的激发光谱与发射光谱各异,给抗体选择、荧光搭配等带来了诸多困扰。需要注意:荧光素的激发波长需要与可激发发光的激光器匹配,荧光素的激发光谱峰值尽可能接近仪器激光的激发光波长。此外,荧光素的激发波长必须选用相应波段检测器接收,以达到同时检测的目的。


荧光素的搭配依据

流式抗体荧光标记搭配主要由3个因素决定:流式细胞仪检测的通道数、需要同时检测的荧光抗体数、厂家抗体的荧光种类及数目
(1) 激光管数目以及每根激光的功能决定检测的通道数量,即可同时检测的指标数量。注意以下两点:
① 流式细胞仪有哪些激光。比如标配的FACSCalibur只有一根488nm的激光,能做FL1/ FL2/ FL3三个颜色;而选配的FACSCalibur配有488nm和635nm两根激光,能做FL1/ FL2/ FL3/ FL4四个颜色。
② 不同型号的仪器同一通道检测荧光素的能力是不一样的,比如FACSCalibur的FL3能检测PE-Cy5/PerCP/PerCP-Cy5.5/PE-Cy7,而Aria只能检测PE-Cy5/PerCP。


(2) 需要同时检测的指标数量超过了仪器能力范围:拆开分管标记。如下例,

计划检测5个指标,而流式细胞仪只有4个通道,首先将指标归成2类,再将样本分成2份,分别检测。如同时检测CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma,那么将样本分成两份,第1份加CD3、CD4、CD8和IL-4,而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。

(3) 厂家提供的荧光素种类及数目:供应商能提供的每种抗体的荧光素是不一样的。尽量选择说明书中有流式图的抗体。

不同型号流式细胞仪的检测通道及可应用的荧光素[1]

荧光素搭配原则:
(1) 根据仪器选择荧光素
① 每个通道只能选择一个荧光素
以calibur为例,FL1选择了FITC就不能选择AlexaFluor488; FL3可检测PE-Cy5 / PerCP / PerCP-Cy5.5等5种荧光,但荧光搭配时只能选择一种荧光被此接收器检测。
② 各通道之间荧光素可随意搭配
如果流式细胞仪有4个通道,每个通道选出1个荧光素就可以组成4个颜色。
(2) 搭配的荧光素之间发射光谱重叠尽量小
荧光的最大发射波长相差越大,荧光重叠就越小,这是由荧光光谱特征决定的。另外,不建议联用APC和Cy5串联荧光,因为他们之间光谱重叠较大,荧光补偿不易调节。

4色以内流式分析荧光素抗体组合

PerCP

FITCPE

PE-Cy5

FITCPE

PE-Cy5.5

FITCPEAPC

PE-Cy7

FITCPEAPC



6色、8色、10色流式分析荧光素抗体组合

6

8

10

FITCAlexa Fluor 488

FITC FITC Alexa Fluor 488

FITCAlexa Fluor 488

PE

PE

PE

PE-Texas RedPE- Alexa Fluor610

PerCP-Cy5.5

PerCP-Cy5.5

PerCP-Cy5.5

PE-Cy7

PE-Cy7

PE-Cy7

APCAlexa Fluor647

APC Alexa Fluor647

APC Alexa Fluor647

APCAlexa Fluor680Alexa Fluor700

APC-Cy7APC-H7

APC-Cy7APC-H7

APC-Cy7APC-H7

AmCyanBD Horizon V500

AmCyanBD Horizon V500

BD Horizon V450

BD Horizon V450



荧光选择注意事项:
1.选择荧光素应考率的因素
① 抗原密度:高表达抗原可以选择任何荧光素标记的抗体检测,低表达的抗原需要用较量荧光素(如PE/APC)标记的抗体检测,从而达到有效区分阴性细胞和阳性细胞的目的。
② 降低自发荧光:选择高波长范围里的荧光染料,自发光在高波长范围里(>600nm)迅速降低。

2.应用FITC标记抗体避免使用酸性缓冲液
应用FITC标记抗体时,避免使用酸性缓冲溶液,因为FITC的荧光特性是PH依赖性的。

3.串联染料确保未发生解偶联
串联染料有可能会发生解偶联,对“光漂白”和使用固定剂的“固定时间”更加敏感。建议设置一个“串联染料单染”作为对照,并在其他通道检测荧光的情况作为对比,以确保未发生解偶联。例如,应用PE/Cy5单染做对照时,分析PE通道的荧光信号。
[1] 刘艳荣. 实用流式细胞术. 北京:北京大学医学出版社,2017(3-39).

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